Tesis doctorales de la Escuela Internacional de Doctorado de la URJC desde el curso 2024/25
Biorrefinería de microalgas: producción de ficoeritrina de alta pureza para el desarrollo de una economía circular
Autor
PIERA RUIZ, ALEJANDRO
Director
BAUTISTA SANTA CRUZ, LUIS FERNANDO
Codirector
ESPADA SANJURJO, JUAN JOSÉ
Fecha de depósito
27-05-2025
Periodo de exposición pública
28 de mayo a 10 de junio de 2025
Fecha de defensa
17-06-2025 - Salón de Grados, Edificio Departamental II, Campus de Móstoles a las 11:00 horas
Modalidad
Presencial
Programa
Tecnologías industriales, Química, Ambiental, Energética, Electrónica, Mecánica, y de los materiales
Mención internacional
No
Resumen
Ciertas especies de microalgas, como Porphyridium sp., objeto de estudio de esta tesis doctoral, tienen la capacidad de sintetizar compuestos de alto valor. Esta microalga roja despierta un gran interés debido a su elevado contenido de ficoeritrina (un tipo de ficobiliproteína), polisacáridos sulfatados y ácidos grasos poliinsaturados. La investigación se ha centrado en la producción de ficoeritrina (PE), un pigmento fotosintético complementario a la clorofila y presente en determinadas microalgas y cianobacterias, que exhibe beneficiosas actividades biológicas, como efectos antioxidantes, antivirales, anticancerígenos, antiinflamatorios y neuroprotectores, además de propiedades fluorescentes excepcionales. Estas características la convierten en un recurso sumamente prometedor para numerosas aplicaciones comerciales en sectores como la salud humana y las industrias alimentaria, farmacéutica, cosmética, nutracéutica y biomédica.
El principal obstáculo al que se enfrentan los procesos de obtención de ficobiliproteínas (PBPs) es acceder y liberar estas moléculas del interior celular para su posterior extracción. En los últimos años han surgido diversas técnicas de extracción fundamentadas en los principios de la química verde, las cuales han ido reemplazando a los métodos de extracción convencionales. Estas técnicas tienen por objetivo, junto con el uso de disolventes ecológicos alternativos (green solvents), la reducción del consumo de energía y del número de operaciones unitarias, y la minimización y gestión de los residuos de extracción como subproducto. Todo ello garantizando la cantidad, calidad y pureza de las biomoléculas recuperadas. En este trabajo, se ha empleado la técnica de extracción asistida por ultrasonidos (UAE), ya que presenta un alto rendimiento de extracción de PBPs y permite preservar la integridad estructural de las mismas, todo ello reduciendo el tiempo de proceso y la cantidad de disolvente requerida.
Los disolventes habitualmente empleados en la extracción de PBPs presentan algunos puntos débiles susceptibles de mejora como son el rendimiento de extracción y la selectividad hacia las PBPs. En consecuencia, están surgiendo nuevas investigaciones basadas en el uso de disolventes ecológicos alternativos. Tal es el caso de los líquidos iónicos (ILs), líquidos compuestos en su totalidad por iones, que resultan prometedores para la extracción de PBPs debido a su alta eficiencia para alterar la pared celular de las microalgas, su elevada selectividad hacia las PBPs, su versatilidad y su capacidad de reutilización, proporcionando mayores rendimientos de extracción que los disolventes convencionales para este fin.
En esta investigación se han utilizado soluciones acuosas de ILs como una alternativa eficaz, eficiente, sostenible e innovadora para extraer PE. Los ILs desempeñan un doble papel en este trabajo. En primer lugar, mejoran la eficiencia de extracción de PE en comparación con los disolventes tradicionales. En segundo lugar, la elevada fuerza iónica del disolvente (debido a los iones que constituyen los ILs) es aprovechada para facilitar la purificación directa del extracto de PE mediante la técnica cromatográfica de interacción hidrofóbica (HIC), que requiere una alta fuerza iónica inicial. Esto elimina la necesidad de implementar etapas de purificación preliminares, reduciendo el número de pasos de purificación a uno solo. Este enfoque ha supuesto una mejora respecto de los métodos convencionales para la producción de PE de alta pureza, que a menudo implican múltiples etapas, lo que puede resultar costoso, generar pérdidas de rendimiento y un mayor impacto ambiental y dificultar la escalabilidad del proceso.
Respecto a la etapa de extracción de PE, se ha desarrollado y optimizado un proceso que combina la técnica de UAE con una novedosa mezcla acuosa de dos ILs, el [Emim]+[EtSO4]- y el [Bmim]+[EtSO4]-. Los resultados han demostrado un efecto sinérgico previamente no reconocido entre estos ILs, incrementando sustancialmente el rendimiento de la extracción de PE en comparación con el mismo método de extracción empleando disolventes convencionales (un incremento del 66,7% respecto al uso de solución tampón de acetato como disolvente; un 86,0% comparado con el tampón fosfato y un 33,5% frente al uso del tampón borato); así como respecto del método de extracción convencional de congelación-descongelación en tampón fosfato, uno de los protocolos más populares, mejorando el rendimiento de extracción de PE en un 13,1%. Además, también se ha demostrado que los ILs empleados se pueden recuperar y reutilizar con éxito en al menos cinco ciclos consecutivos de extracción, con una reducida pérdida en el rendimiento de extracción de PE (< 6%) en comparación con el uso de ILs frescos.
Pese a que los métodos de extracción de PBPs son cada vez más eficientes y selectivos, sigue siendo necesaria la purificación de los extractos para alcanzar los niveles de pureza y calidad exigidos por gran número de aplicaciones comerciales. En este trabajo se ha empleado la HIC, técnica cromatográfica que separa y purifica los analitos en función de su hidrofobicidad superficial, de manera que los analitos con mayor hidrofobicidad se unen con más fuerza a los ligandos hidrofóbicos de la resina que forma la fase estacionaria, mientras que los analitos menos hidrofóbicos se unen débilmente o pasan a través de la columna cromatográfica sin quedar retenidos. De este modo, se ha desarrollado y optimizado un método de purificación de PE en una única etapa, alcanzado una pureza mayor que 4, correspondiente al grado analítico de pureza. Para ello se estudiaron seis resinas de interacción hidrofóbica con matriz de agarosa con diferentes características fisicoquímicas y texturales, como el tipo de ligando, su concentración, la naturaleza del brazo espaciador, el tamaño de partícula, el tamaño de poro y su uniformidad. Con cuatro de las seis resinas estudiadas se alcanzó el grado analítico de pureza. La resina Butyl-S Sepharose™ 6 Fast Flow exhibió la mayor tasa de recuperación de PE de grado analítico (72,95%), por lo que se seleccionó para estudiar la optimización del proceso y evaluar la purificación de extractos con ILs reutilizados. Los resultados no evidenciaron diferencias significativas en el uso de ILs frescos y reutilizados, logrando en ambos casos el nivel analítico de pureza. Con el fin de validar el método para su aplicación a extractos ricos en otras PBPs, se aplicó también con éxito a la purificación de ficocianina (PC) y aloficocianina (APC) a partir de un extracto de la cianobacteria Arthrospira platensis, alcanzando el grado analítico de pureza para la PC y mejorando sustancialmente la pureza de la APC.
Respecto al aprovechamiento de la biomasa residual (BMR) generada en la etapa de extracción de PE, aspecto fundamental del concepto de biorrefinería que posibilita transformar dichos residuos en productos de valor, se han investigado dos vías de conversión: la conversión termoquímica mediante licuefacción hidrotérmica (HTL) para la obtención de biocrudo y la conversión biológica a través de digestión anaerobia (AD) para la producción de biogás. La HTL transforma la biomasa húmeda en biocrudo, así como en una fase acuosa que contiene compuestos orgánicos solubles, una fase sólida denominada hidrochar y una fase gaseosa, bajo condiciones de alta temperatura y presión. La principal ventaja de esta técnica es su capacidad de procesar una amplia variedad de residuos con alto contenido de agua, aspecto que suele suponer una importante limitación para la valorización de residuos mediante otras tecnologías fisicoquímicas. Por su parte, la AD es un proceso consolidado a nivel industrial para la generación de biogás a partir de diferentes tipos de biomasa, y probablemente la ruta más sostenible para el aprovechamiento de residuos orgánicos.
En relación con el proceso de HTL, se ha investigado el efecto de la temperatura, el tiempo de residencia y el uso de un cosolvente, isopropanol, en la producción de biocrudo. El mayor rendimientos se alcanzó al utilizar un cosolvente y aplicar la temperatura de reacción más alta estudiada, 325 °C, durante 20 minutos. En estas condiciones, se obtuvo un rendimiento de biocrudo del 32,2% p/p, con un poder calorífico de 35,3 MJ·kg-1 y la mayor energía recuperada, alcanzando el 48,0% con respecto a la BMR procesada. No obstante, este valor se encuentra por debajo de los rangos típicos de energía recuperada reportados en la literatura para estudios de HTL de biomasas de microalgas ricas en lípidos, las cuales son las más exitosas para la conversión a biocrudo, con valores que varían entre el 49-83%. Esto se atribuye al bajo contenido lipídico y al alto contenido proteico de la microalga Porphyridium sp., lo que requiere temperaturas de proceso superiores a las evaluadas en este trabajo para lograr la mayor conversión en biocrudo.
Respecto a la producción de biogás a través de la AD, se ha investigado el uso de la BMR en condiciones mesofílicas y con una relación sustrato:inóculo 1:2, referida a sólidos volátiles (SV). Asimismo, se ha evaluado el uso del glicerol, un subproducto de la producción de biodiesel en biorrefinerías, como cosustrato y los resultados se han comparado con los obtenidos empleando la fase acuosa obtenida en el proceso de HTL y la propia microalga sin ser sometida a ningún tratamiento previo. La mayor producción de biometano se logró empleando el glicerol como cosustrato, con 47,0 mL CH4·g-1SV, seguida por la biomasa sin tratar de Porphyridium sp., con 39,12 mL CH4·g-1SV, y la BMR como único sustrato, con 34,12 mL CH4·g-1SV. La digestión anaerobia de la fase acuosa del HTL no produjo biometano, probablemente debido a la presencia de compuestos tóxicos o recalcitrantes basados en estructuras cíclicas de nitrógeno, los cuales dificultan la degradación anaerobia, así como al mayor contenido de nitrógeno amoniacal de este sustrato. En general, la producción de biometano resultó inferior a los valores reportados en la literatura para biomasa de Porphyridium sp. en condiciones similares. Esto pudo deberse a una reducida actividad biológica del inóculo, a una demanda química de oxígeno insuficiente, o al elevado contenido de cenizas presente en la biomasa.
Finalmente, basándose en los resultados experimentales de laboratorio, se han simulado los procesos a escala industrial utilizando el software SuperPro Designer para evaluar la sostenibilidad de la biorrefinería dedicada a la producción de PE de grado analítico a partir de la microalga Porphyridium sp., junto con la valorización de la BMR generada durante el proceso de extracción para la producción de biocrudo y biogás.
Se ha empleado la metodología de Análisis de Ciclo de Vida (LCA) con el propósito de identificar los puntos críticos y las alternativas más favorables para reducir los impactos ambientales de la biorrefinería. Se ha establecido como unidad funcional la producción de 10 g de PE de pureza grado analítico, utilizando el enfoque denominado "de la cuna a la puerta" como alcance del sistema, analizando las etapas de biorrefinería del cultivo de la microalga, su cosechado y secado, la extracción y purificación de PE, el procesamiento posterior de PE para la obtención del producto final y la valorización energética de la BMR mediante HTL o AD. Además, también se ha evaluado el impacto asociado al tratamiento y gestión de los residuos de las principales corrientes residuales generadas durante la producción de la PE de grado analítico y la valorización energética de la BMR.
Mediante el software LCA For Experts, las bases de datos Ecoinvent y Sphera LCA Database y aplicando la metodología CML 2001, se han analizado 9 categorías de impacto ambiental: el agotamiento de los recursos abióticos, la acidificación, la eutrofización, el potencial de calentamiento global, la ecotoxicidad humana, terrestre y del agua dulce, la formación de ozono fotoquímico y la demanda de energía primaria. Se han planteado cuatro escenarios base sin valorización energética de la BMR, contemplando diferentes niveles de reutilización de la fase móvil de la HIC y de los ILs, y se ha seleccionado el escenario base más apropiado según aspectos técnicos. Luego, se ha realizado una comparación entre este escenario y dos que incorporan la valorización energética de la BMR mediante HTL o AD. Finalmente, se ha seleccionado el escenario más favorable de los dos, y se ha elaborado un tercer escenario optimizado que incluye el uso de agua de mar para el cultivo de la microalga, y una mayor tasa de reutilización de ILs.
La etapa de purificación ha sido la fase crítica de la biorrefinería en los 8 escenarios analizados y en todas las categorías de impacto evaluadas. Esto se debe al gran volumen de fase móvil requerido, que representó una proporción de 237,5:1 en relación con el volumen de extracto procesado. No obstante, se ha observado que, al recuperar únicamente la fase móvil consumida en las etapas cromatográficas de estabilización y acondicionamiento de la columna, se logró reducir el impacto ambiental total de la biorrefinería, en todas las categorías analizadas, en un 50%, y este valor aumenta hasta el 70% si también se recupera la fracción de fase móvil de la etapa de elución que no contiene PE. El foco principal es la cantidad requerida de (NH4)2SO4, donde la producción de esta sal supone prácticamente la totalidad de la contribución del impacto ambiental de las diferentes categorías analizadas, salvo en la categoría de eutrofización donde aproximadamente el 20% de la contribución se debe al tratamiento y gestión de la corriente residual rica en sales.
La etapa de HTL fue la segunda con el mayor impacto ambiental, contribuyendo entre el 0,09% y el 14,73% a las diferentes categorías de impacto. Le siguen la etapa de post-procesamiento, con un rango del 0,01 - 6,82%, la etapa de extracción, con un 0,10 - 3,7%, y un máximo del 12,58% en la demanda de energía primaria cuando no se recuperan los ILs, así como la etapa de cosechado y secado, con un 0,00 - 1,26% del global. Por el contrario, las etapas más favorables fueron las de AD, con la menor contribución en las diferentes categorías de impacto, entre -0,69% y 0,15%, mostrando valores negativos debido al uso de lodo anaeróbico del tratamiento de aguas residuales urbanas como materia prima, y la etapa de cultivo de la microalga, entre -0,15% y 0,47%, por el balance neto negativo de emisiones de CO2.
Por otro lado, y aunque los ILs empleados en esta investigación se consideren frecuentemente como disolventes "verdes" o más ventajosos que otros ILs u orgánicos, su producción ha mostrado un impacto significativo en todas las categorías de impacto de la etapa de extracción, lo que resalta la importancia de su reutilización.
En definitiva, la presente tesis doctoral propone el diseño y desarrollo de un esquema de biorrefinería de múltiples productos a través de la integración y optimización de los procesos, la reutilización y valorización de los residuos generados, y el desarrollo de productos de alto valor. En concreto, la producción de ficoeritrina de alta pureza a partir de la alga roja unicelular Porphyridium sp., junto con la valorización de la biomasa residual generada en el proceso de extracción para la producción de biocrudo y biogás, y el estudio de sostenibilidad del esquema propuesto mediante la metodología de LCA. Este enfoque pretende proporcionar una alternativa potencial y económicamente viable, debido al mayor valor de los bioproductos en comparación con los biocombustibles por sí solos. Sin embargo, apenas existen trabajos que describan la producción conjunta de bioproductos de alto valor añadido y biocombustibles a partir de microalgas, a pesar de que se conoce ampliamente su diversidad de compuestos valiosos
