Tesis doctorales de la Escuela Internacional de Doctorado de la URJC desde el curso 2024/25
Pharmacology of Neuropathic Pain: Biomarkers, In Vitro and In Vivo Evaluation of Novel Cannabinoid Compounds
Autor
SANZ GONZÁLEZ, MARINA
Director
PASCUAL SERRANO, DAVID
Codirector
GOICOECHEA GARCÍA, CARLOS
Fecha de depósito
23-09-2025
Periodo de exposición pública
24 de septiembre a 7 de octubre de 2025
Fecha de defensa
Sin especificar
Programa
Ciencias de la Salud
Mención internacional
Solicitada
Resumen
Introducción:
El dolor neuropático representa un desafío clínico a nivel global, solo en España se diagnostican anualmente 400.000 nuevos casos, con mayor incidencia en mujeres y personas mayores de 55 años. Su impacto trasciende lo físico: el 65% de los pacientes restringe actividades diarias y el 82% reporta deterioro significativo en su calidad de vida, frecuentemente asociado a comorbilidades como insomnio (60%), fatiga (42%) y trastornos depresivos (34%).
El dolor neuropático presenta una fisiopatología compleja y presenta una baja eficacia de los tratamientos actuales, generando insatisfacción en el 40% de los pacientes. En este contexto, el sistema endocannabinoide se perfila como una alternativa terapéutica prometedora, destacando la investigación de nuevos ligandos sintéticos para los receptores CB1 y CB2. Además, la respuesta al tratamiento varía considerablemente entre individuos, lo que pone de manifiesto la necesidad de enfoques terapéuticos más personalizados y eficaces.
No obstante, persisten retos cruciales: la evidencia clínica sigue siendo limitada, existen vacíos en la estandarización de dosis y vías de administración, y se reportan efectos adversos como sedación y riesgo potencial de dependencia. Esta tesis doctoral se enmarca en la necesidad de superar las limitaciones actuales mediante un abordaje multidisciplinar y traslacional que integre: 1) Screening de nuevos compuestos cannabinoides derivados del indazol, 2) Evaluación del nuevo compuesto cannabinoide PGN34 in vitro e in vivo en modelos animales de dolor neuropático inducido por paclitaxel, 3) realizar una revisión sistemática para la búsqueda de nuevos marcadores de dolor neuropático, los cuales podrían validar los resultados experimentales preclínicos también. El objetivo final es contribuir al desarrollo de terapias más seguras, eficaces y personalizadas para esta condición discapacitante.
Metodología:
- Estudio I
Se llevó a cabo una revisión sistemática y meta-análisis sobre biomarcadores relacionados con mediadores inflamatorios en el dolor neuropático.
La metodología se llevó a cabo siguiendo las pautas del Cochrane Handbook for Systematic Reviews of Interventions y la lista de verificación Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA). El protocolo del estudio fue registrado en PROSPERO con el ID CRD420223237693.
La búsqueda de literatura se realizó en seis bases de datos: PubMed, Web of Science, Scopus, Cochrane Library, EMBASE y CINAHL, hasta el 5 de abril de 2022. Para la selección de estudios, se incluyeron estudios observacionales (transversales, de cohortes y de casos y controles) que evaluaran biomarcadores cuantitativos en sangre o líquido cefalorraquídeo. Un criterio clave de inclusión fue la presencia de un grupo de control de pacientes con neuropatía pero sin dolor. No se incluyeron pacientes con otras patologías concomitantes. La fiabilidad entre evaluadores se evaluó mediante el coeficiente kappa (κ), considerando valores superiores a 0.7 como alta concordancia. El riesgo de sesgo en los estudios incluidos se evaluó utilizando la Newcastle Ottawa Scale (NOS).
Para el análisis cuantitativo, se utilizaron los paquetes de software estadístico dmetar y metafor en R.
- Estudio II:
Dada la necesidad de buscar nuevas estrategias terapéuticas, se llevó a cabo un screening y la caracterización funcional de nuevos compuestos derivados de indazol. La caracterización funcional in vitro de los nuevos compuestos derivados de indazol se llevó a cabo utilizando el conducto deferente aislado de ratón ya que es un modelo tisular ampliamente reconocido y utilizado para el estudio y la caracterización de los efectos de los cannabinoides. El conducto deferente de ratón es una preparación de músculo liso inervado que sirve como un bioensayo in vitro altamente sensible y cuantitativo para agonistas de receptores cannabinoides.
En el conducto deferente de ratón la contracción puede ser desencadenada mediante estimulación eléctrica, siendo el ATP el neurotransmisor predominante en las respuestas evocadas eléctricamente. Los agonistas cannabinoides actúan sobre receptores presinápticos (incluyendo CB1 y CB2, además de receptores opioides µ, ƙ, δ) para inhibir la liberación de noradrenalina y ATP, resultando en una disminución de la respuesta contráctil. Por el contrario, los antagonistas son capaces de bloquear este efecto inhibitorio, mientras que los agonistas inversos pueden aumentar la contracción. La confirmación de la actividad agonista y la selectividad por tipo de receptor (CB1 o CB2) se realizó probando si el efecto observado era bloqueado y revertido por los antagonistas selectivos CB1 (AM251) y/o CB2 (AM630).
Se realizaron análisis estadísticos utilizando GraphPad Prism 8.0.2. Los datos se presentan como valores medios ±SEM (error estándar de la media). Las diferencias estadísticas se evaluaron mediante ANOVA de dos vías seguido del análisis post hoc de Tukey. Un valor p inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
- Estudio III:
Tras la publicación de los datos de screening, bioensayos y ensayos de docking de nuevos compuestos en 2014 por nuestro grupo de investigación y el IQM-CSIC, este estudio tiene como objetivo caracterizar un nuevo compuesto cannabinoide derivado de indazol, PGN34. Se evaluó su actividad antinociceptiva en diferentes modelos de dolor y sus efectos tanto en administración aguda como crónica. Además, se evalúan sus posibles efectos secundarios. Los resultados se comparan con WIN55,212-2, un agonista cannabinoide conocido, y con antagonistas selectivos de los receptores CB1 (AM251) y CB2 (AM630) para verificar la especificidad de la unión. PGN34 fue desarrollado por su potencial perfil cannabinoide, con una afinidad preferente por el receptor CB2 (Ki 2 μM) y baja afinidad por CB1 (Ki >40 μM).
La metodología incluyó estudios in vitro en una línea celular de microglía murina (BV2) para evaluar la proliferación y la liberación de citoquinas pro-inflamatorias (IL-1β, IL-6, TNFα) en respuesta a LPS, con y sin PGN34 y antagonistas cannabinoides.
Los estudios in vivo se realizaron en ratas Wistar macho y hembra, siguiendo las directrices éticas internacionales y pasando el comité de ética de la universidad Rey Juan Carlos. Se utilizaron los siguientes modelos de dolor:
- Dolor muscular orofacial: Inducido por inyección de suero salino hipertónico (HS) en el músculo masetero, midiendo el número de sacudidas de la pata trasera. El objetivo fue establecer la dosis a la que se trabajaría en el modelo de dolor neuropático.
- Dolor neuropático periférico (CIPN): Inducido por administración de paclitaxel (PTX, 8 mg/kg i.p.). Se evaluaron los efectos de PGN34 en administración aguda (después de establecer la neuropatía) y crónica (concomitante con PTX). Las pruebas conductuales incluyeron Von Frey (alodinia mecánica), test de acetona (alodinia térmica/frío) y Rodent Pincher (hiperalgesia mecánica).
Para evaluar los efectos secundarios, se administró PGN34 de forma repetida y se realizaron pruebas como el test de preferencia de lugar condicionada (CPP) para el efecto de recompensa/adicción, la tétrada cannabinoide (hipokinesia, hipo/hipertermia y catalepsia), el test de laberinto elevado en cruz para la ansiedad, y el test de Splash para la anhedonia.
Se realizaron análisis estadísticos utilizando GraphPad Prism 8.0.2. Los datos se presentan como valores medios ±SEM (error estándar de la media). En función del test se presentan los datos normalizados o en porcentajes respecto a su umbral basal. Las diferencias estadísticas se evaluaron mediante ANOVA de dos vías seguido del análisis post hoc de Tukey, o por t-student. Un valor p inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Estudio I:
La búsqueda de literatura arrojó 16,278 registros, de los cuales 16 estudios fueron incluidos para el análisis cualitativo y 12 para la síntesis cuantitativa después de eliminar duplicados y realizar los cribados correspondientes. La fiabilidad inter-evaluador para la selección de estudios fue alta (κ = 0.721).
Se analizaron un total de 1403 sujetos en el análisis cuantitativo, de los cuales 784 presentaban neuropatías dolorosas. Se utilizaron diversos métodos de diagnóstico del dolor neuropático, como el Neuropathy Symptom Score (NSS), Leeds Assessment of Neuropathic Symptoms and Signs (LANSS) y el Toronto Clinical Scoring System (TCSS), entre otros.
Para el meta-análisis cuantitativo, se evaluaron los niveles de tres biomarcadores principales: Proteína C Reactiva (CRP), Interleucina-6 (IL-6) y Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-α); en ninguno de ellos se encontraron diferencias estadísticamente significativas y en todos un potencial sesgo de publicación.
La revisión identificó 68 biomarcadores en total, pero solo 12 fueron lo suficientemente comunes para permitir comparaciones entre estudios, y de estos, solo tres estaban relacionados con la inflamación (CRP, IL-6, TNF-alfa) y pudieron incluirse en el meta-análisis cuantitativo. La ausencia de resultados significativos en la comparación de neuropatías dolorosas y no dolorosas, a pesar de la robustez metodológica (alta fiabilidad inter-evaluador, evaluación de sesgo adecuada), resalta la compleja naturaleza del dolor neuropático y los desafíos en la identificación de biomarcadores.
La dificultad para estandarizar las condiciones de análisis entre estudios, incluso al medir la misma proteína, se destacó como principal imitación en la obtención de resultados significativos de esta revisión.
- Estudio II:
El diseño de agonistas parciales, como PP34_1H (Emax ~66%), podría ofrecer ventajas terapéuticas al reducir efectos secundarios no deseados mediados por el receptor CB₁ (por ejemplo, catalepsia o efectos psicoactivos), en contraste con los SCRAs de alta eficacia como 5F-ADB-PINACA (Emax >95%). Este enfoque está en línea con las estrategias actuales en el desarrollo de cannabimiméticos terapéuticos, en las que se prioriza una eficacia moderada para mejorar el perfil de seguridad.
Además, el compuesto borilado MeOPHC5 mantuvo una eficacia considerable (Emax 67.8%) a pesar de su modificación estructural, lo que respalda informes previos que indican que la borilación en derivados de indazol puede mejorar la estabilidad metabólica y la vida media, sin comprometer la afinidad ni la función del receptor.
Por último, NP86 representa un caso poco común de antagonismo dual competitivo/alostérico sobre los receptores cannabinoides. Su capacidad para desplazar tanto la EC₅₀ como el Emax del agonista WIN55,212-2 sugiere una inhibición multidiana de las vías de señalización cannabinoide, lo que podría aprovecharse para contrarrestar los efectos de SCRAs de alta potencia, abriendo potencialmente nuevas vías terapéuticas para el tratamiento de los trastornos por consumo de cannabinoides.
Se necesitan más estudios de seguridad y toxicidad antes de pasar a fases más avanzadas de la caracterización farmacológica.
- Estudio III:
La evaluación in vitro de PGN34 en células BV2 mostró una reducción significativa de la proliferación celular y de la liberación de IL-1β e IL-6 inducidas por LPS. La modulación de citoquinas sugirió la participación de CB1 y CB2, destacando una posible inhibición indirecta de vías proinflamatorias vía CB1. En el modelo de dolor muscular orofacial, PGN34 (3–5 mg/kg) mostró un efecto antinociceptivo dosis-dependiente, mediado principalmente por CB2. En el modelo de dolor neuropático inducido por paclitaxel, se confirmó la instauración de alodinia e hiperalgesia en ambos sexos. PGN34 aumentó significativamente los umbrales de alodinia mecánica (Von Frey) en administración aguda, con implicación mixta de CB1 y CB2, más marcada para CB1 en hembras. No se observaron efectos significativos en alodinia térmica e hiperalgesia mecánica, aunque CB1 pareció modular el dolor por frío en hembras. La administración crónica de PGN34 (5 mg/kg) atenuó significativamente la alodinia e hiperalgesia inducidas por paclitaxel, con mayor eficacia y persistencia en hembras, y previno la pérdida de peso, especialmente en machos. Finalmente, PGN34 no mostró efectos adictivos, anhedónicos, ansiosos, ni alteraciones fisiológicas tras administración repetida, a diferencia de WIN55,212-2, lo que indica un buen perfil de seguridad.
CONCLUSIONES:
En conjunto, los resultados obtenidos respaldan la seguridad de nuevos compuestos cannabinoides sintéticos derivados del indazol. Como se ha visto, una baja Emax podría garantizar la seguridad frente los problemas de adicción que generan esos compuestos, ejemplo demostrado en la caracterización de PGN34. El potencial terapéutico de PGN34 como un cannabinoide eficaz en el tratamiento del dolor neuropático inducido por quimioterapia. En el modelo preclínico, PGN34 mostró efectos antinociceptivos robustos durante la administración crónica concomitante con paclitaxel, atenuando significativamente la alodinia y la hiperalgesia, con efectos más persistentes en hembras. A su vez, evitó la pérdida de peso inducida por el tratamiento quimioterápico, particularmente en machos, y no se asociaron efectos adversos relevantes a las dosis evaluadas. Estos hallazgos reflejan un claro dimorfismo sexual en la respuesta tanto al paclitaxel como al PGN34, lo cual resulta especialmente relevante ante la creciente necesidad de terapias personalizadas.
En cuanto a los mecanismos implicados, los estudios in vitro y en el modelo de dolor orofacial agudo sugirieron una participación preferente del receptor CB2. No obstante, los resultados obtenidos en el modelo de dolor neuropático (CIPN) agudo evidenciaron una implicación mixta de los receptores CB1 y CB2, lo que apunta a una modulación más compleja del sistema endocannabinoide según el tipo de dolor y el sexo.
Estos datos experimentales adquieren una relevancia especial cuando se contrastan con los hallazgos de la revisión sistemática, la cual analizó la utilidad de biomarcadores inflamatorios en el dolor neuropático. A pesar de que proteínas como la CRP, IL-6 y TNF-alfa fueron las más estudiadas, el metanálisis no evidenció diferencias significativas en sus niveles entre pacientes con y sin dolor neuropático. La elevada heterogeneidad metodológica y la falta de marcadores específicos subrayan la dificultad de trasladar los mecanismos moleculares implicados en modelos animales a la práctica clínica.
Así, los hallazgos preclínicos con PGN34 no solo demuestran su eficacia y seguridad, sino que también ponen de manifiesto la necesidad urgente de identificar biomarcadores fiables que permitan validar estas dianas terapéuticas en humanos. La integración de estudios experimentales bien diseñados con revisiones sistemáticas rigurosas puede ser clave para avanzar hacia estrategias de tratamiento más eficaces y personalizadas en el abordaje del dolor neuropático.
