Tesis doctorales de la Escuela Internacional de Doctorado de la URJC desde el curso 2024/25
Determinación de alcaloides tropánicos, opiáceos y pirrolizidínicos en alimentos para lactantes y niños de corta edad y en productos de panadería: avances analíticos y evaluación del impacto del procesado para garantizar la seguridad alimentaria
Autor
VERA BAQUERO, FERNANDO LEONARDO
Director
SIERRA ALONSO, MARÍA ISABEL
Codirector
MORANTE ZARCERO, SONIA
Fecha de defensa
24-07-2025
Calificación
Sobresaliente cum laude
Programa
Ciencias
Mención internacional
No
Resumen
En los últimos años, el control de contaminantes y compuestos que pueden afectar negativamente a los alimentos se ha intensificado, impulsado por avances en la investigación científica y en la legislación alimentaria. Entre estos compuestos, se han identificado toxinas naturales como los alcaloides tropánicos (TAs), opiáceos (OAs) y pirrolizidínicos (PAs), cuya presencia en alimentos representa un riesgo relevante para la salud pública. Estas toxinas son producidas por ciertas, plantas como Datura stramonium (estramonio), Papaver somniferum L. (amapola) o Senecio vulgaris (hierba cana), y pueden contaminar cultivos de cereales, semillas, hierbas aromáticas y especias. Esta contaminación ocurre principalmente por la coexistencia de estas plantas como malas hierbas en campos agrícolas, un problema que se ve agravado por la similitud entre sus semillas y las de los cultivos, así como por las limitaciones en el uso de fitosanitarios en la agricultura ecológica.
La presencia de estas toxinas es especialmente preocupante en productos elaborados a partir de cereales y en infusiones a base de hierbas, dada su amplio empleo en la dieta. Por ello, es crucial reforzar los controles en alimentos destinados a toda la población, prestando especial atención a los grupos más vulnerables, como los lactantes y niños de corta edad, así como otros consumidores sensibles. Los efectos tóxicos de estos alcaloides, que incluyen alteraciones neurológicas, gastrointestinales y, en casos extremos, riesgos letales, han llevado a la Unión Europea a establecer límites estrictos mediante el Reglamento (UE) 2023/915, especialmente para alimentos infantiles y alimentos elaborados a base de cereales para lactantes y niños de corta edad. Sin embargo, la detección y control de estas toxinas son desafiantes debido a la complejidad de las matrices alimentarias, la diversidad de sus propiedades fisicoquímicas y la influencia de procesos culinarios como la fermentación y el horneado en su estabilidad. Esta Tesis Doctoral aborda estos retos mediante el desarrollo de metodologías analíticas avanzadas, sostenibles y altamente sensibles para la detección, cuantificación y control de TAs, OAs y PAs, priorizando los principios de la Química Analítica Verde (Green Analytical Chemistry, GAC) y la Preparación de Muestra Verde (Green Sample Preparation, GSP), que buscan minimizar el impacto ambiental de los procesos analíticos mediante la reducción de disolventes, energía y residuos. Por tanto, estas metodologías contribuyen además al cumplimiento de los Objetivos de Desarrollo Sostenible (ODS), en particular el ODS 2 (hambre cero y seguridad alimentaria), mediante el control de contaminantes en alimentos que mejoran su inocuidad; y al ODS 12 (producción y consumo responsables), al fomentar el uso de técnicas más sostenibles y responsables con el medio ambiente. La investigación se fundamenta en una revisión bibliográfica exhaustiva que identifica las fuentes de contaminación por TAs, OAs y PAs, destacando su presencia en cereales (trigo sarraceno, maíz, mijo, sorgo), pseudocereales, legumbres, semillas oleaginosas, hierbas aromáticas, especias, tés e infusiones, y subrayando la necesidad de métodos analíticos robustos para garantizar el cumplimiento de los límites regulatorios. En base a esto, la Tesis Doctoral se centra en dos objetivos principales: desarrollar métodos analíticos para el control de TAs en alimentos para lactantes y niños de corta edad y para el control simultáneo de TAs, OAs y PAs en productos de panadería, así como el estudio del efecto del procesado culinario.
Para el control de TAs en alimentos infantiles, se diseñaron metodologías basadas en cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) y ultra alta eficacia (UHPLC) acopladas a espectrometría de masas en tándem (MS/MS), optimizando técnicas de preparación de muestra que cumplen con los principios de la GSP. Un avance significativo fue el desarrollo de un método mediante HPLC-TQ-MS/MS con una columna quiral para la separación enantiomérica de hiosciamina en infusiones a base de hierbas para lactantes y niños de corta edad. Este método, logró una buena resolución quiral, garantizando alta sensibilidad y selectividad. La preparación de muestras se mejoró mediante extracción en fase sólida (SPE) con una sílice mesoestructurada tipo HMS, sintetizada y funcionalizado con grupos sulfónicos por co-condensación (HMS-SO₃⁻(co)). Este adsorbente, que superó a los comerciales como OASIS® MCX, logró una adsorción completa con solo 50 mg de material, un factor de preconcentración de 167 y una reutilización de hasta cinco ciclos, minimizándose la generación de residuos y resultando en una metodología más alineada con la GSP y los ODS. La validación del método demostró su robustez y fue aplicado al estudio de infusiones infantiles comerciales, detectándose niveles elevados de hiosciamina, con varios productos superando el límite legal de 0,20 µg/kg, lo que evidencia la necesidad de controles más rigurosos para proteger a los lactantes y niños de corta edad. Asimismo, se encontró una mezcla desigual de los dos enantiómeros en las muestras contaminadas, lo que confirmó la importancia de evaluar el contenido de cada enantiómero para evitar una sobreestimación de la exposición a (−)-hiosciamina en niños.
En alimentos elaborados a base de cereales para lactantes y niños de corta edad, como papillas para niños de 4-6 meses, se optimizó un procedimiento combinado de extracción sólido-líquido (SLE) y SPE utilizando una sílice mesoestructurada tipo MCM-41, y funcionalizada con grupos sulfónicos mediante post-síntesis. Con solo 75 mg de adsorbente, se alcanzaron recuperaciones cercanas al 100% para atropina y escopolamina, con un factor de preconcentración de 33 y reutilización de hasta siete ciclos, lo que reduce el impacto ambiental. El análisis por UHPLC-TQ-MS/MS se aplicó al análisis de 20 productos comerciales adquiridos entre 2016 y 2024, y todas las muestras mostraron contaminación por atropina y/o escopolamina. Nueve de estos productos presentaron niveles que superaban el límite reglamentario de 1,0 µg/kg. No obstante, se observó una reducción en los niveles de atropina en los productos comercializados a partir de septiembre de 2021, lo que sugiere una mejora en el control de estos contaminantes tras la entrada en vigor del Reglamento (UE) 2023/915. Estos resultados destacan la presencia de TAs en alimentos infantiles y refuerzan la necesidad de establecer estrategias de mitigación y una vigilancia más sistemática para garantizar la seguridad alimentaria en poblaciones vulnerables.
Para el control simultáneo de TAs, OAs y PAs en productos de panadería, se desarrollaron métodos analíticos que abordan la coexistencia de estas toxinas en matrices complejas como pan, tostadas, galletas y palitos de pan, priorizando la eficiencia y la sostenibilidad. Un método inicial basado en HPLC con detección por arreglo de diodos (HPLC-DAD) permitió la separación de tres TAs (atropina, escopolamina, anisodamina) y cinco OAs (morfina, codeína, tebaína, papaverina, noscapina) en palitos de pan de preparación casera con harina de maíz y contaminados con semillas de Datura stramonium y Papaver somniferum L. Para la extracción de los analitos de interés, se optimizó un procedimiento basado en SLE, seguido de evaporación y reconstitución previo a su inyección en el sistema HPLC-DAD. Los estudios de degradación térmica en palitos de pan elaborados con semillas de amapola, incorporadas en la masa o utilizadas como cobertura, y horneados a 180 °C durante 20 minutos, mostraron reducciones significativas en los niveles de diversos alcaloides. Se observaron degradaciones del 7 al 65 % para atropina, del 35 % para escopolamina y del 49 % para anisodamina; así como reducciones de hasta el 100 % para morfina y codeína, y entre el 14 y el 58 % para tebaína, papaverina y noscapina. La degradación de morfina y codeína fue más pronunciada en las muestras donde las semillas se usaron como cobertura, lo que sugiere que la exposición directa al calor favorece su descomposición.
Para mejorar la sensibilidad y abordar la detección simultánea de múltiples alcaloides, se desarrolló un método empleando UHPLC-IT-MS/MS que separó 29 alcaloides (2 TAs, 6 OAs, 21 PAs/PANOs). Este método, pionero en lograr una separación cromatográfica efectiva de las tres familias de alcaloides reguladas en un único análisis, se combinó con un procedimiento optimizado de SLE-SPE que minimiza el uso de disolventes, cumpliendo con los principios de la GAC. La extracción utilizó agua acidificada con HCl al 1%, seguida de purificación con cartuchos comerciales OASIS® MCX, que ofrecieron recuperaciones ≥93% y un factor de preconcentración de 10. Aplicado a 15 productos de panadería comerciales, el método confirmó la presencia simultánea de TAs (atropina y escopolamina), OAs (codeína, morfina, noscapina, oripavina, papaverina y tebaína) y PAs (equimidina N-óxido, europina, europina N-óxido, heliotrina, intermedina, intermedina N-óxido, lasiocarpina, licopsamina, licopsamina N-óxido y senecionina) con concentraciones en algunos casos por encima de los límites legales, y detectó niveles elevados de OAs no regulados, como noscapina y papaverina, lo que sugiere la necesidad de actualizar la legislación para fortalecer la seguridad alimentaria.
Buscando una alternativa más sostenible, basada en el uso de subproductos agrícolas para la preparación de fases adsorbentes, se sintetizó un adsorbente mesoestructurado tipo SBA-15 utilizando cáscara de arroz como fuente de silicio, y bifuncionalizado con grupos sulfónicos (-SO3H) y octadecilo (C18), denominado RH-SBA-15-SO3H-C18. Este material, con alta área superficial y modo mixto de fase inversa e intercambio catiónico, mostró resultados comparables a los cartuchos comerciales OASIS® MCX, logrando recuperaciones similares con 150 mg de adsorbente y un factor de preconcentración de 10, lo que demuestra la viabilidad de este adsorbente sostenible para el control de contaminantes. Su síntesis a partir de residuos agroalimentarios promueve la economía circular, alineándose con el ODS 12 y los principios de GSP. Aplicado al análisis de panes sin gluten de elaboración casera con harina de maíz, trigo sarraceno, semillas de amapola, hierbas aromáticas (orégano y albahaca) y cáscara de psyllium, el método desarrollado permitió detectar niveles altos de TAs y OAs en las muestras, lo que demuestra su viabilidad.
Posteriormente, se investigó la influencia de la fermentación alcohólica y del horneado en el proceso de elaboración del pan. Para ello, se analizaron masas recién preparadas, tras la etapa de fermentación (70 % de humedad, 30 °C, 45 min) y después del horneado (180 °C, 45 min), utilizando el método SLE-SPE-UHPLC-IT-MS/MS con el adsorbente RH-SBA-15-SO₃H-C18. Las muestras contenían ingredientes potencialmente contaminados, como harinas de maíz y trigo sarraceno (fuentes de TAs), semillas de amapola (fuentes de OAs), hierbas aromáticas y psyllium (potenciales fuentes de PAs). Los resultados mostraron que las harinas aportaban TAs, principalmente atropina y escopolamina, mientras que las semillas de amapola contenían OAs como codeína, morfina, noscapina, papaverina y tebaína. No se detectaron PAs en las hierbas o el psyllium, posiblemente debido a su baja concentración. La fermentación redujo los TAs, con escopolamina más susceptible que atropina, por su menor estabilidad en condiciones fermentación, mientras que el horneado afectó significativamente a los OAs, como oripavina y tebaína que se degradaron completamente y papaverina que aumentó debido a transformaciones químicas inducidas por el calor. Los PANOs añadidos intencionadamente se convirtieron en PAs durante el horneado, mientras que las bases libres, como equimidina, licopsamina y senecionina mostraron incrementos muy destacables después del proceso de fermentación más horneado, sugiriendo procesos de desmetilación térmica. La matriz alimentaria ejerció un efecto protector, reduciendo la degradación de los alcaloides naturales en comparación con los añadidos intencionadamente mediante estándares, lo que resalta la complejidad de las interacciones químicas durante el procesado.
En definitiva, esta Tesis Doctoral ofrece herramientas analíticas innovadoras y sostenibles para el control de toxinas naturales específicas, como los TAs, OAs y PAs, en alimentos dirigidos a poblaciones vulnerables. La confirmación de la presencia simultánea de TAs, OAs y PAs en productos comerciales subraya la necesidad urgente de reforzar los sistemas de vigilancia y actualizar la legislación vigente. Asimismo, el estudio del efecto del procesado culinario aporta información clave para la industria alimentaria, orientada a mitigar la exposición a estos compuestos. En conjunto, los resultados obtenidos constituyen una contribución relevante a la seguridad alimentaria y a la protección de la salud pública.
